X-Gal/IPTG即用型溶液

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法。現(xiàn)在使用的許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)（MCS），它并不破壞閱讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。因此，宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱(chēng)為α-互補(bǔ)。由α-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ⁺細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可避免地導(dǎo)致無(wú)α-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這種重組子的篩選，又稱(chēng)為藍(lán)白斑篩選。如用藍(lán)白斑篩選則經(jīng)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的鈣化菌平板37℃倒置培養(yǎng)12-16hr后，含有插入片段重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落，而沒(méi)有插入片段的質(zhì)粒細(xì)菌形成藍(lán)色菌落。

● 配制方法：

50mg/ml IPTG  5ml：取250mg IPTG，溶于5ml無(wú)菌水中，過(guò)濾除菌后-20℃貯存。

20mg/ml X-Gal  5ml：取100mg X-gal，溶于5ml 二甲基甲酰胺（DMF），棕色瓶中-20℃貯存。此試劑無(wú)需滅菌。

● 實(shí)驗(yàn)程序：

1 轉(zhuǎn)化平板的制備：

向鋪好的含有相應(yīng)抗生素的固體瓊脂平板表面加入16 μl的IPTG(50 mg/ml)、40 μl的X-gal(20 mg/ml)，使用無(wú)菌的彎頭玻璃棒將其均勻的涂開(kāi)，盡量使溶解X-gal的二甲基甲酰胺揮發(fā)干凈。

2 轉(zhuǎn)化

               i.      取部分連接產(chǎn)物加到50-100 μl感受態(tài)細(xì)胞中（感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)剛從-70℃冰箱取出放于冰浴上，待剛剛解凍時(shí)加入連接產(chǎn)物，連接產(chǎn)物的加入量不超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一），輕彈混勻，冰浴30分鐘。

             ii.      將離心管置于精確42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴中放置2-3分鐘，其間不要搖動(dòng)離心管。

            iii.      向離心管中加入250-500 μl37℃預(yù)熱的SOC或LB(不含抗生素)培養(yǎng)基，150rpm，37℃振蕩培養(yǎng)45分鐘。此步目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

           iv.      將離心管中的菌液混勻，吸取100 μl加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂培養(yǎng)基上，用無(wú)菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻涂開(kāi)。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。

3 檢測(cè)

將得到的白色菌落接種1-5 ml LB培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，保存菌種后提取質(zhì)粒，應(yīng)用PCR或酶切方法鑒定插入片段是否正確。

X-gal/IPTG發(fā)表文章列表：

1. [2022 IF=2.7] Functional verification of the JmLFY gene associated with the flowering of Juglans mandshurica Maxim..

Author: Jiayou Cai, Ruoxue Jia, Ying Jiang, Jingqi Fu, Tianyi Dong, Jifeng Deng, Lijie Zhang.

Journal: Peer J Published March 7, 2023

Institution: Shenyang Agricultural University

Paper link：https://doi.org/10.7717/peerj.14938