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單鏈DNA Marker由不同長度的單鏈DNA分子混合而成，7條帶的大小為20，25，30，35，40， 50，75 nt。35 nt 濃度約為100 ng/μl，其余條帶濃度約為50 ng/μl。該產(chǎn)品已經(jīng)含有上樣緩沖液，使用前70度處理5分鐘后可以直接上樣。該Marker適用于跑尿素變性膠，電泳后使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102），核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）或核酸染料如RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe All（貨號：GR004）均可以得到清晰的條帶分離效果。

產(chǎn)品內(nèi)附帶2×TBE尿素上樣緩沖液（Cat：DL080-01），方便待檢樣品的上樣。以每次上樣5 μl計算，該產(chǎn)品可以使用大約25次。

● 保存條件和運輸：

-20℃貯存；有效期2年；濕冰運輸。

● 使用方法：

注：以下使用方法均以8×10cm凝膠厚1.0mm示例，其他規(guī)格凝膠請適當調(diào)整。

一. 凝膠制備：

1.1 可以選擇DNA尿素PAGE電泳試劑盒（Cat：RTE4102））或按照以下程序制膠：

表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)

單鏈DNA長度	最佳凝膠濃度	尿素（克）	40%PAA （29:1）	10×TBE	補水到總體積	10%APS	TEMED
200-1000 nt	5%	2.1克	0.625 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
50-400 nt	8%	2.1克	1 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
30-300 nt	10%	2.1克	1.25 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
10-150 nt	15%	2.1克	1.875 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl
5-120 nt	20%	2.1克	2.5 ml	0.5 ml	5 ml	50 μl	5 μl

1.2在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。

1.3靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。

1.4去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)

	各組份體積（ml）
凝膠濃度	尿素	40%PAA（29:1）	10×TBE	滅菌水	10%APS	TEMED
4%	0.84克	0.2 ml	0.2 ml	補水至體積2 ml	20 μl	2 μl

1.5將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。

1.6靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。

二. 樣品制備：

2.1 取適量體積單鏈DNA Marker樣品（不用添加上樣緩沖液）；待測樣品與等體積的2×TBE尿素上樣緩沖液（Cat：DL080-01）混合，70℃處理5分鐘，冰浴制冷后待上樣。

三.電泳：

3.1. 預電泳（可選）：電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200V預電泳30分鐘。電泳結束后，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘余的尿素。

3.2.上樣：根據(jù)梳齒確定Marker上樣量，一般是10齒1mm厚梳子上樣5 μl，15齒1mm厚梳子上樣3 μl。

3.3. 連接電源線，打開電源開關，按照以下條件電泳。

	恒電壓	起始電流	結束電流	電泳時間	適用條件
推薦電壓	200 V	15-20 mA/板膠	10-15 mA/板膠	60+ min	最佳電壓，最優(yōu)的分辨率

3.4. 等待上樣緩沖液的溴酚藍指示前沿到凝膠底部時終止電泳，取出凝膠進行后續(xù)實驗。

變性膠濃度	溴酚藍	二甲苯菁
5%	35 nt	130 nt
8%	19 nt	75 nt
10%	15 nt	55 nt
15%	10 nt	52 nt
20%	8 nt	35 nt

四．染色：

用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5103），核酸PAGE電泳染色試劑盒（Cat：RTS5102）或核酸快速高靈敏度染色試劑盒（Cat：RTS5101）染色均可以得到清晰的條帶分離效果。注：如果使用核酸染料染色，RealSafe Red（貨號：GR002）或RealSafe All（貨號：GR004）核酸染料結合單鏈核酸效果最佳，強烈建議使用以便獲得最佳效果的膠圖。其余染料如GelRed，Goldview，EB等染色效果不好。

● 注意事項：

1. 單鏈DNA Marker產(chǎn)品適用于變性PAGE垂直電泳，不適用于水平瓊脂糖凝膠電泳。

● 電泳示例：

1. 使用單鏈DNA PAGE電泳染色試劑盒（貨號：RTS5103）染色：