25bp DNA ladder

● 產(chǎn)品編號及規(guī)格：

RTM444          50次 (250 μl)    

● 產(chǎn)品組成：

● 產(chǎn)品簡介：

本產(chǎn)品是由8條帶狀雙鏈DNA條帶組成的精準定量Marker，適用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中DNA條帶大小和含量的分析。8條帶的大小分別為25，50，100，150，200，300，400，500bp。其中200bp bp條帶為加亮帶，含量為100ng/5μl，其余條帶濃度為50ng/5μl。

本產(chǎn)品為雙鏈DNA Marker，適用于非變性的PAGE電泳和瓊脂糖凝膠電泳，不適用于尿素PAGE電泳。由于片段較小，如使用瓊脂糖分離，建議使用高分辨率瓊脂糖凝膠電泳分離。

按照每次上樣5 μl計算，該產(chǎn)品可以使用50次。

● 儲存、效期及運輸：

  -20℃ 貯存;有效期3年；濕冰運輸。

● 使用方法：

一、 TBE-PAGE凝膠分離：

1.1制備凝膠步驟：

1.1.1參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。

1.1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

     注：25bp DNA ladder適用于配制15%TBE-PAGE膠。

1.1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-2 cm的無水乙醇，使凝膠表面保持平整。

1.1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和乙醇層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合

表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于1mm厚度小板膠)

1.1.5去除覆蓋在分離膠上的乙醇；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1mm厚度小板膠)

1.1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內，避免產(chǎn)生氣泡。

1.1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。

注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。

1.2 電泳：

1.2.1 將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入1×TBE電泳液，1 ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。

1.2.2 取待測樣品，加入相應體積6×Native PAGE DNA上樣緩沖液，如5 μl樣品加1 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 25bp DNA ladder已經(jīng)含有上樣緩沖液，1 mm厚10齒梳子直接上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調整上樣量。

1.2.3 連接電源線，打開電源開關。200 V穩(wěn)壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達距離凝膠下沿二分之一位置時結束電泳（~50bp），此時溴酚藍指示前沿在凝膠下沿邊界（~17bp）。

1.3染色：

1.3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。

1.3.2 染色液配制：

     TBE-PAGE膠可以使用RealSafe類染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料（貨號：GR002）進行染色。即用型染色液配制：

1.3.3染色和觀察：

     凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60 rpm染色30 分鐘。紫外光或藍光儀下觀察。

 二、 瓊脂糖凝膠分離：

2.1 瓊脂糖凝膠制備：

    由于片段較小，建議選用高分辨率瓊脂糖（貨號AR1036）制膠。以下步驟以制備50 ml 3%凝膠為例：

稱取1.5 g瓊脂糖于玻璃三角瓶中，加入50 ml 1×TAE，5 μl RealSafe Red核酸染料或其他核酸染料（如EB，GoldView），混勻，蓋好瓶蓋，微波爐中火加熱至沸騰，輕搖混勻，重復1-2次至瓊脂糖完全溶解，無可見顆粒。倒入制膠容器中，插好梳子，常溫凝固30-50分鐘至凝膠完全凝固。

2.2 電泳：

取待測樣品，加入相應體積6×DualColor DNA loading buffer，如10 μl樣品加2 μl 上樣緩沖液，短暫離心后取5-10 μl上樣。 25bp DNA ladder 1 mm厚10齒梳子上樣5 μl，其余梳齒和厚度凝膠適量調整上樣量。

建議電泳條件：凝膠濃度為3％，電泳電壓8-10 v/cm（單位電壓指電泳槽陰陽極之間的距離電壓，如陰極陽極之間的距離為20 cm，可以用160-200 V電壓進行穩(wěn)壓電泳），待溴酚藍指示前沿距離凝膠末端2 cm時終止電泳，電泳時間35-40分鐘。

2.3觀察條帶。

注：使用EB或Goldview染料時，由于染料本身帶正電荷較多，隨著電泳時間的延長，染料會向陰極聚集，導致小片段核酸結合的染料含量降低，會出現(xiàn)小片段的DNA片段紫外燈下亮度變弱或不可見。此時可以將膠浸泡于含有染料的電泳緩沖液中染色15-20分鐘即可看到小片段。使用RealSafe類染料可以直接觀察條帶。

2.4 實驗示例：