RNA尿素電泳推薦電泳Marker：單鏈RNA Marke（貨號：RTM505）
RNA尿素PAGE電泳試劑盒（貨號RTE4103）
RNA Urea PAGE Electrophoresis Kit
● 產(chǎn)品組成：
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序號
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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保存條件
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1
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RTE4103-01
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40%PAA(29:1) （RNase-free）
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100 ml
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4℃
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2
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RTE4103-02
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10×TBE（RNase-free）
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500 ml
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RT
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3
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RTE4103-03
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尿素（電泳級）
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220 g
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RT
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4
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RTE4103-04
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RNase-free水
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100 ml
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4℃
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5
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RTE4103-05
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2×RNA上樣緩沖液
(尿素變性膠，RNase-free)
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1 ml
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-20℃
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6
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RTE4103-06
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RNA核酸染料
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0.5 ml
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4℃
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7
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AP020P
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APS（干粉）
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5 ml
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RT (配制后-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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9
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
核酸尿素 PAGE 電泳是研究寡核苷酸和RNA電泳的重要研究手段?？梢詸z測2-500堿基的寡核苷酸或RNA片段，理論上可以分辨出相差一個核苷酸的片段。
本公司提供的RNA尿素PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制各種濃度的PAGE膠，使用方便。
按照每次制備7 ml 8%凝膠（大小10×8cm，1mm厚度）計算，試劑盒可使用至少60次。
● 貯存和運輸：
試劑盒按照標簽溫度貯存，有效期一年。試劑盒常溫運輸。
● 使用說明：
一、制備凝膠：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml RNase-free水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應盡量減少室溫存放時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時間延長，應考慮更換使用-20度保存的10% APS。
1.1．參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2．分離膠配制：根據(jù)表格一，將不同體積的成分混合，漩渦攪拌至尿素徹底溶解。
表一 TBE-尿素PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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RNA長度
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最佳凝膠濃度
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尿素(克)
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40%PAA
（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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200-1000 nt
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5%
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2.1克
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0.625 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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50-400 nt
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8%
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2.1克
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1 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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30-300 nt
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10%
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2.1克
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1.25 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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40-200 nt
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12%
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2.1克
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1.5 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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10-150 nt
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15%
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2.1克
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1.875 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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6-100 nt
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20%
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2.1克
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2.5 ml
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0.5 ml
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至體積5 ml
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50 μl
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5 μl
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1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。
1.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-尿素PAGE 4%濃縮配方表 (總體積2 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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尿素
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40%PAA（29:1）
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10×TBE
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RNase-free水
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10%APS
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TEMED
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0.84克
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0.2 ml
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0.2 ml
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補至體積2 ml
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20 μl
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2 μl
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1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.7常溫靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調節(jié)APS的加入量。
二、電泳：
2.1. 預電泳：拔出梳子，用1×TBE緩沖液徹底沖洗加樣孔2-3次，去除殘余的尿素。電泳槽內(nèi)外加入適量1×TBE緩沖液穩(wěn)壓200 V預電泳30分鐘。
注：試劑盒配套的10×TBE緩沖液和RNase-free水僅夠配制凝膠用，1×TBE電泳緩沖液原料和RNase-free水請自己準備，配方如下：
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終濃度
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順序
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原料
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1升
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5 升
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89 mM
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1
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Tris堿 [MW121.14]
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10.8 克
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54克
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2 mM
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2
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EDTA 2Na·2H2O [MW372.24]
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0.744 克
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3.72克
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89 MM
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3
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硼酸 [MW61.83]
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5.5 克
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27.5克
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4
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RNase-free水最后定容至
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1 升
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5 升
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最后pH在8.2-8.3之間，可以不用調節(jié)pH，記錄每批pH
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2.2. 取 3-5 μl樣品，加入等體積2×RNA上樣緩沖液，70℃處理5分鐘后立即冰浴，上樣。
2.3. 連接電源線，打開電源開關，按照以下條件電泳。
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恒電壓
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起始電流
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結束電流
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電泳時間
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適用條件
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推薦電壓
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200V
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15-20 mA/板膠
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8-15 mA/板膠
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50+ min
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最佳電壓，最優(yōu)的分辨率
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2.4. 根據(jù)下表溴酚藍指示前沿位置判斷條帶位置，取出凝膠進行后續(xù)實驗。
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變性膠濃度
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溴酚藍
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二甲苯菁
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5%
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35 nt
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130 nt
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8%
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19 nt
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75 nt
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10%
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15 nt
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55 nt
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12%
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12 nt
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55 nt
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15%
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10 nt
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52 nt
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20%
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5 nt
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50 nt
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三、染色：
3.1染色液配制：取一合適的容器，加入100 ml 1×TBE，隨后加入10 μl RNA核酸染料混勻。
3.2 染色：取下凝膠放入染色液中，常溫下?lián)u床輕輕地搖動凝膠染色，最佳的染膠時間為15-20 分鐘，這取決于凝膠的厚度、聚丙烯酰胺的濃度和 RNA 的長短。凝膠越厚或聚丙烯酰胺的濃度越高，染色所需要的時間就越長。注：染色溶液至少可重復使用2-3次。如果不立即再用的話，建議將用過的染色溶液冷藏避光保存。
3.3 觀察：紫外燈下觀察條帶。
