TBE-PAGE電泳可以選擇PAGE電泳Marker 作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。
DNA非變性PAGE電泳試劑盒（貨號RTE4101）
DNA Native PAGE
Electrophoresis Kit
● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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保存條件
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AC2913-01
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30%PAA(29:1)
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100 ml
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4℃
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TB001
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5×TBE
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500 ml
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RT
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AP020P
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APS（干粉）
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5 ml
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RT（配制后-20℃貯存）
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TA0761-01
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TEMED
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0.5 ml
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4℃，避光
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DL070
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6×Native-PAGE DNA上樣緩沖液
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1 ml
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4℃
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● 產(chǎn)品簡介：
非變性 PAGE 電泳是研究DNA構(gòu)象變化的常用手段，在非變性條件下DNA的泳動與電荷、片段大小、DNA結(jié)合的蛋白及折疊構(gòu)象都有關(guān)系。非變性PAGE電泳是研究單鏈 PCR片段構(gòu)象多態(tài)性（SSCP-PCR，single-strand conformation polymorphism-PCR）的重要研究手段。在SSCP測定中，雙鏈DNA（dsDNA）變性為單鏈DNA（ssDNA），每一條單鏈DNA都基于他們的內(nèi)部序列呈現(xiàn)不同的折疊構(gòu)象，即使相同長度的單鏈DNA因其堿基順序不同，甚至單個堿基的不同都會形成不同的構(gòu)象。這些不同構(gòu)象的ssDNA 在非變性PAGE中得到分離。另外，非變性PAGE還可以分離小片段的雙鏈DNA，與瓊脂糖電泳相比，對低于500bp的雙鏈DNA片段有更優(yōu)秀的分辨率。
本公司提供的DNA非變性PAGE電泳試劑盒包含凝膠制備及電泳所需的全部試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制各種濃度的PAGE膠，使用方便。
本試劑盒大約可以配制20-45塊常規(guī)大小（8×10cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠厚度決定：0.75mm厚度凝膠可以配制45塊膠，1mm厚度凝膠可以配制至少35塊膠，1.5mm厚度凝膠可以配制至少20塊膠。
● 貯存和效期：
本產(chǎn)品常溫運(yùn)輸，按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
10% APS配制-5 ml：
將0.5 gAPS干粉溶于5 ml滅菌水中，徹底溶解后分裝，1 ml/支，-20℃?zhèn)浯?，每次取一管使用?0% APS應(yīng)盡量減少室溫存放時間，以防失效。10%APS在4℃有效期為一周，-20℃有效期6個月。若發(fā)現(xiàn)凝膠聚合時間延長，應(yīng)考慮更換使用-20度保存的10% APS。
一、制備凝膠步驟：（以下步驟為制備8×10cm厚度1.0mm膠）
1.1 參照凝膠模具說明書，裝配好凝膠模具。
1.2按照表一將不同體積的成分在小燒杯或試管中混合；最后加入10%APS和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-5
cm的水層，使凝膠表面保持平整。
1.4靜置10-20分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合
表一 TBE-PAGE分離膠配方表 (總體積5 ml，適用于厚度1.0 mm小板膠)
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各組份體積（ml）
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最佳DNA分離范圍
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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70-450 bp
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6%
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3
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1.0
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1.0
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0.05
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0.005
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60-460 bp
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8%
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2.66
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1.34
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1.0
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0.05
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0.005
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50-300 bp
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10%
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2.33
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1.67
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1.0
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0.05
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0.005
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40-200 bp
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12%
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2
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2.0
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1.0
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0.05
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0.005
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25-150 bp
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15%
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1.5
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2.5
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1.0
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0.05
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0.005
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5-100 bp
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20%
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0.66
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3.34
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1.0
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0.05
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0.005
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注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
1.5去除覆蓋在分離膠上的水層；按照表二將不同體積成分在一個小燒杯或試管中混合；最后加入10%過硫酸銨和TEMED，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
表二 TBE-PAGE 4%濃縮配方表 (總體積1.5 ml，適用于1.0mm厚度膠)
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各組份體積（ml）
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凝膠濃度
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滅菌水
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30%PAA（29：1）
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5×TBE
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10%APS
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TEMED
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4%
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1.0
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0.2
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0.3
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0.02
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0.002
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1.6將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達(dá)前玻璃板的頂端；將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
1.7靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
二、電泳：
2.1 1×TBE電泳液配制：取100ml 5×TBE，加蒸餾水400 ml，即配成500
ml 1×TBE。將凝膠板固定在電泳裝置上，往上槽和下槽中加入足夠1×TBE電泳液。 用1ml吸頭沖洗加樣孔1-2次。
2.2 取待測樣品，加入相應(yīng)體積6×Native PAGE DNA上樣液，如5 μl樣品加1 μl 上樣液，短暫離
心后取5-10 μl上樣。TBE-PAGE中判斷雙鏈DNA大小可以選擇20bp
DNA ladder（貨號：RTM441）作為DNA Marker。
2.3 連接電源線，打開電源開關(guān)。200 V穩(wěn)壓電泳。至二甲苯菁指示前沿到達(dá)凝膠三分之二位置時結(jié)束電泳。
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TBE-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
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200
V
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20-25 mA/板膠
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10-15
mA/板膠
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70+min
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三、染色：
3.1 漂洗：玻璃板上拆下凝膠后，適量蒸餾水漂洗3-5分鐘。
3.2 染色液配制：
TBE-PAGE膠可以使用EB或RealSafe類染料后染染色，以下程序用RealSafe Red核酸染料進(jìn)行染色。即用型染色液配制：
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即用型RealSafe核酸染色液
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100 ml
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1×TBE
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100 ml
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RealSafe Red核酸染料
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20 μl
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3.3染色：
凝膠浸泡于即用型染色液中，常溫避光搖床40-60rpm染色30 分鐘。
五、常見問題：
1. 為何 SSCP-PCR帶型有復(fù)合條帶？
原因之一：可能是殘留的 PCR 引物跟單鏈的 DNA 結(jié)合形成遷移率不同的條帶。解決方法是稀釋PCR或電泳前將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。
原因之二：可能是PCR產(chǎn)物用量過高，彼此復(fù)性。解決辦法是將PCR產(chǎn)物稀釋后4-8倍后使用。
2. 如何提高電泳分辨率？
可以在配膠時加入甘油（終濃度為5%-10%），因為甘油是弱變性劑，能部分展開 DNA 折疊結(jié)構(gòu)，增加表面積，增加電泳時位移差異。但加入甘油后粘性變大，電泳速度變慢，因此只適合常溫電泳使用，不要4℃電泳。如果條件允許，最好同時做加甘油和不加甘油的電泳實(shí)驗。
實(shí)驗示例
使用RTE4101 DNA非變性PAGE電泳試劑盒產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1. [2022 IF=6] A novel ?uorescent sensor
based on aptamer recognition and DNA walker ampli?cation strategy and its
determination of 17b-estradiol.
Author: Yajun Zhang, Licong Jia, Wei Wang,
Meng Jiang, Hongying Zhang, LingMei Niu
Product: RTE4101 DNA非變性PAGE電泳試劑盒
Journal: Arabian Journal of Chemistry. 16
(2023) 105340.
Institution：School of Public Health, Hebei Medical
University
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.arabjc.2023.105340
2. [2022 IF=8.9] Ultra-Sensitive Detection
of the SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein via a Clustered Regularly Interspaced
Short Palindromic Repeat/Cas12a-Mediated Immunoassay.
Author: Wen Yin,Leyao Li,Yang Yang,Yuxin Yang,
Ruijing Liang, Lixin Ma, Junbiao Dai, Guobin M，Yingxin Ma
Product: RTE4101 DNA非變性PAGE電泳試劑盒
Journal: ACS Sens. 2024
Institution：Shenzhen Institute of Advanced
Technology, Chinese Academy of Sciences
Paper link：https://doi.org/10.1021/acssensors.4c00432