動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒（組織樣品）
Animal Nuclear and
Cytoplasmic Protein Extraction Kit for Tissues
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產(chǎn)品貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8303
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動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒（組織樣品）
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50 次
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● 產(chǎn)品簡介：
在研究細胞時經(jīng)常要研究細胞的不同組份，而研究得最多的兩個細胞組份就是細胞核和細胞漿。分離核蛋白和胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細胞內(nèi)的定位，而且可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如EMSA(也稱gel
shift)，footprinting等。動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒(Animal
Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單方便地從組織中抽提細胞核蛋白與胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成組織細胞核蛋白與細胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等實驗。
本試劑盒是通過裂解緩沖液在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，破壞細胞膜，釋放出細胞漿蛋白，然后通過離心得到完整的細胞核（細胞核可以重懸于細胞核貯存緩沖液中
-80℃貯存）；細胞核用核蛋白提取試劑I裂解，配合核酸酶Benzonase消化掉核酸，離心得到變性核蛋白；或者使用核蛋白提取試劑II裂解，離心得到非變性（活性）核蛋白。一般情況下，胞漿蛋白與核蛋白之間的交叉污染低于10%。
對于組織樣品，如果每個樣品的重量不超過50
mg，本試劑盒可以抽提50個樣品。
● 產(chǎn)品組成：
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產(chǎn)品編號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD8303-01
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裂解緩沖液A
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45 ml
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-20℃
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RTD8303-02
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裂解緩沖液B
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1 ml
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4 ℃
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RTD8303-03
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細胞核貯存緩沖液
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0.5 ml
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-20℃
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RTD8303-04
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核蛋白提取試劑I（變性）
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5 ml
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-20℃
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RTD8303-05
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核蛋白提取試劑II（非變性）
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5 ml
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-20℃
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RTD8303-06
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臺盼藍染色液
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0.5 ml
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4℃
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PM1790S-01
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PMSF溶液（100 mM）
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1 ml
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-20℃
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RTT2106-01
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Benzonase（250 U/μl）
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50 μl
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-20℃
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DT0140P-01
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1 M DTT
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1 ml
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4℃(配制后-20℃)
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● 貯存條件和運輸：
根據(jù)標簽溫度貯存；有效期一年；試劑盒濕冰運輸。
● 用前必讀：
1. 離心機請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑，根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照1:100添加）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
3. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用方法：
一 胞漿蛋白和核蛋白的提?。?/b>
1.1準備溶液：常溫溶解試劑盒中的試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當量的裂解緩沖液A，在使用前加入PMSF溶液和/或磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）和1/1000體積的1
M DTT，隨后立即放于冰上待用。
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組份
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一次提取需要體積
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PMSF溶液
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1
M DTT
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Benzonase
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裂解緩沖液A
（步驟1.2.2和1.3.1）
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800 μl
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8 μl
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0.8 μl
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-
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核蛋白提取試劑I（變性）
（步驟1.4.1.2）
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100 μl
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1 μl
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0.1 μl
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1 μl
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核蛋白提取試劑II（非變性）（步驟1.4.2.2）
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50 μl
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0.5 μl
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-
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-
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1.2
組織胞漿蛋白提取：
1.2.1把組織盡可能切成非常細小的碎片。
1.2.2按照每50
mg組織加入400
μl裂解緩沖液A（含抑制劑和DTT）的比例在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿，勻漿需在冰浴進行，勻漿后吸出勻漿液到離心管中，冰浴5分鐘。
1.2.3
關(guān)鍵步驟：加入20
μl裂解緩沖液B（按照裂解緩沖液A體積的1/20加入），混勻，冰浴5-10分鐘。
注1：此步驟盡量不要漩渦震蕩沉淀，否則得到的胞漿蛋白可能會污染核蛋白。
注2：裂解緩沖液對不同組織細胞的裂解能力有不同，敏感細胞裂解5分鐘足夠，其他細胞冰浴時間不要超過10分鐘。
1.2.4
4℃ 16000g 離心5分鐘，取80%上清即為胞漿蛋白，保存?zhèn)溆谩?
注：吸取上清時千萬不要觸及沉淀，可以只取80%體積上清，以免胞漿蛋白中污染細胞核。新鮮的肝臟組織用本產(chǎn)品裂解后獲得的上清，其胞漿蛋白濃度約為2-5
mg/ml，不同狀態(tài)的不同組織有所不同。
1.3
收集細胞核：
1.3.1
徹底去除步驟1.2.4離心管內(nèi)上清，沉淀中再次加入400
μl裂解緩沖液A（含PMSF
和DTT），用1 ml吸頭吹打重懸沉淀至沉淀完全散開（注：渦旋震蕩不易懸浮沉淀），冰浴5分鐘。
注：此步驟目的是徹底漂洗沉淀中殘余的未裂解細胞，可以大大提高細胞核的純度。
1.3.2
4℃ 16000g 離心5-10分鐘，徹底去除上清，沉淀即為完整的細胞核。
注：盡量完全把上清去除干凈，否則細胞核中會污染胞漿蛋白。
1.3.4
可選步驟：取10
μl細胞核溶液，加入10
μl臺盼藍染色液，混勻后，常溫放置2分鐘，顯微鏡下觀察細胞核的染色情況，提取良好的細胞核為均一藍色，沒有粘連（如圖）。
1.4 細胞核蛋白提?。?/b>
1.4.1 變性核蛋白提取：
注：此步驟使用含有SDS的核蛋白提取試劑I，完全裂解核膜，釋放出細胞核內(nèi)容物，提取的是完全變性的核蛋白，適用于SDS-PAGE電泳Western
Blot檢測。
1.4.1.1
取一管50
μl細胞核溶液，4℃
16000g 離心2分鐘，去除上清，保留沉淀。
1.4.1.2
沉淀中加入100
μl核蛋白提取試劑I（變性）（含PMSF和DTT）和1
μl Benzonase，吸頭重懸沉淀，37℃處理30分鐘至幾乎無可見不溶物。
注：加入核蛋白提取試劑I（變性）后，細胞核裂解釋放出大量核酸，溶液可能非常粘稠，核酸酶Benzonase可以消化掉核酸，降低粘度。
1.4.1.3
4℃16,000g離心10分鐘，立即吸取上清至一預冷的離心管中，即為抽提得到的變性核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-80℃凍存。新鮮的50 mg肝臟組織用100 μl提取試劑I裂解后獲得的上清，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）測定濃度，其核蛋白濃度約為1-3
μg/μl，不同細胞略有不同。
1.4.2 非變性核蛋白提?。?/b>
注：此步驟使用高鹽緩沖液（核蛋白提取試劑II）使得細胞核收縮，核酸結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）與核酸分離，擴散到細胞核外部，離心后上清中為非變性（活性）核蛋白，適用EMSA，轉(zhuǎn)錄因子活性分析等實驗。
1.4.2.1
取一管50
μl細胞核溶液，4℃
16000g 離心2分鐘，去除上清，保留沉淀。
1.4.2.2
沉淀中加入50
μl核蛋白提取試劑II（非變性）（含PMSF，不要添加DTT），吸頭重懸沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)混勻30
min，至最后得到的溶液無可見懸浮物。
注：如不能旋轉(zhuǎn)混勻，可以冰浴30 min，每隔5分鐘混勻一次。
1.4.2.3
4℃16,000g離心10分鐘，立即吸取上清至一預冷的離心管中，即為抽提得到的活性核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃凍存。新鮮的50 mg肝臟組織用50 μl提取試劑II裂解后獲得的上清，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）測定濃度，其核蛋白濃度約為1-3
μg/μl，不同細胞略有不同。
二 關(guān)于胞漿蛋白和核蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評價：
2.1蛋白產(chǎn)量：
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組織
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組織重量
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胞漿蛋白
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核蛋白
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腦
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~50 mg
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~1.2 mg
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~70 μg
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肝臟
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~50 mg
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~3.4 mg
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~80 μg
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心臟
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~50 mg
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~1.6 mg
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~140 μg
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肺
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~50 mg
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~1.5 mg
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~70 μg
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2.2 胞漿蛋白和核蛋白質(zhì)量評價：
蛋白分區(qū)提取的質(zhì)量評價首先看提取的蛋白是否是分區(qū)蛋白，其次要看分區(qū)蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的分區(qū)蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的分區(qū)蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的胞漿內(nèi)參和細胞核內(nèi)參（下表），可以初步確認提出的是胞漿蛋白還是核蛋白。蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照，與總蛋白相比，胞漿蛋白內(nèi)參或核內(nèi)參是否有明顯富集。交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測蛋白樣品，如關(guān)注胞漿蛋白中是否有細胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin
B1檢測胞漿蛋白，檢測無條帶即說明胞漿蛋白與細胞核組分無交叉污染。用目標蛋白抗體檢測分區(qū)蛋白，驗證是否可以檢測到目的蛋白，蛋白大小是否符合預期。
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位置
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內(nèi)參名稱
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大小 kD
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備注
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胞漿蛋白內(nèi)參
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GAPDH
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37
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β-Actin
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45
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β-Tubulin
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55
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推薦
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核內(nèi)參
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Histone H3
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17
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H3出存在于細胞核內(nèi)，也存在于線粒體中，胞漿中可以檢測到
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PCNA
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36
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Lamin B1
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68
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推薦
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