動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）
Animal Nuclear and
Cytoplasmic Protein Extraction Kit for Cells
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產(chǎn)品貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTD8301
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動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒（細(xì)胞樣品）
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50 次
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● 產(chǎn)品簡介：
在研究細(xì)胞時經(jīng)常要研究細(xì)胞的不同組份，而研究得最多的兩個細(xì)胞組份就是細(xì)胞核和細(xì)胞漿。分離核蛋白和胞漿蛋白，不僅可以用于研究蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位，而且可以用于轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面的研究，例如EMSA(也稱gel
shift)，footprinting等。動物核蛋白與胞漿蛋白提取試劑盒(Animal
Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit)提供了一種比較簡單方便地從培養(yǎng)細(xì)胞中抽提細(xì)胞核蛋白與胞漿蛋白的方法。約90分鐘就可以完成培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白的分離。抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，報告基因檢測以及酶活力測定等實驗。
本試劑盒是通過細(xì)胞核提取緩沖液在低滲透壓條件下，使細(xì)胞充分膨脹，破壞細(xì)胞膜，釋放出細(xì)胞漿蛋白，然后通過離心得到完整的細(xì)胞核（細(xì)胞核可以重懸于細(xì)胞核貯存緩沖液中
-80℃貯存）；細(xì)胞核用核蛋白提取試劑I裂解，配合核酸酶Benzonase消化掉核酸，離心得到變性核蛋白；或者使用核蛋白提取試劑II裂解，離心得到非變性（活性）核蛋白。一般情況下，胞漿蛋白與核蛋白之間的交叉污染低于10%。
對于細(xì)胞樣品，如果每個樣品的數(shù)量5×106-1×107，本試劑盒可以抽提50個樣品。
● 產(chǎn)品組成：
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產(chǎn)品編號
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名稱
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規(guī)格
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貯存
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RTD8301-01
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細(xì)胞裂解緩沖液A
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45 ml
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-20℃
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RTD8301-02
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細(xì)胞裂解緩沖液B
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1 ml
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4 ℃
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RTD8301-03
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細(xì)胞核貯存緩沖液
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0.5 ml
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-20℃
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RTD8301-04
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核蛋白提取試劑I（變性）
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5 ml
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-20℃
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RTD8301-05
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核蛋白提取試劑II（非變性）
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5 ml
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-20℃
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RTD8301-06
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臺盼藍(lán)染色液
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0.5 ml
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4℃
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PM1790S-01
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PMSF溶液（100 mM）
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1 ml
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-20℃
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RTT2106-01
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Benzonase（250 U/μl）
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50 μl
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-20℃
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DT0140P-01
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1 M DTT
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1 ml
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4℃(配制后-20℃)
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● 貯存條件和運輸：
根據(jù)標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年；試劑盒濕冰運輸。
● 用前必讀：
1. 離心機請調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機中進行。
2. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑，根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時按照1:100添加）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。
3. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）。
● 使用方法：
一 胞漿蛋白和核蛋白的提?。?/b>
1.
1準(zhǔn)備溶液：常溫溶解試劑盒中的試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當(dāng)量的細(xì)胞裂解緩沖液A，在使用前加入PMSF溶液和/或磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）和1/1000體積的1
M DTT，隨后立即放于冰上待用。
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組份
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一次提取需要體積
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PMSF溶液
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1
M DTT
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Benzonase
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細(xì)胞裂解緩沖液A
（步驟1.4.1和1.5.1）
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800 μl
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8 μl
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0.8 μl
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-
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核蛋白提取試劑I（變性）
（步驟1.6.1.2）
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100 μl
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1 μl
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0.1 μl
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1 μl
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核蛋白提取試劑II（非變性）（步驟1.6.2.2）
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50 μl
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0.5 μl
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-
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-
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1.2
準(zhǔn)備細(xì)胞：
1.2.1
對于貼壁細(xì)胞：用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。450
g 4℃離心5
min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細(xì)胞：450
g 4℃離心5
min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。
1.3 按照下表大體估算提取溶液使用體積：
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細(xì)胞類型
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培養(yǎng)器皿
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細(xì)胞數(shù)量
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細(xì)胞沉淀體積（PCV）（μl）
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細(xì)胞裂解緩沖液A（μl）
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懸浮細(xì)胞
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5-10×106
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＞50
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400
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貼壁細(xì)胞
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96孔板
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~1×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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24孔板
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~5×105
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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6孔板
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~2.5×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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25cm2培養(yǎng)瓶
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~2×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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75cm2培養(yǎng)瓶
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~8×106
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~80
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35
mm培養(yǎng)皿
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~2×106
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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60
mm培養(yǎng)皿
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~5×106
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~50
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100
mm培養(yǎng)皿
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~1.5×107
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調(diào)整細(xì)胞數(shù)目到5-10×106
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注：(二百萬，2×106)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。
1.4
胞漿蛋白提?。?
1.4.1細(xì)胞沉淀中加入準(zhǔn)備好的400
μl細(xì)胞裂解緩沖液A（含抑制劑和DTT），用1 ml吸頭吹打重懸細(xì)胞沉淀5-10次，把細(xì)胞沉淀完全懸浮并分散開,冰浴5分鐘。
1.4.2
加入20
μl 細(xì)胞裂解緩沖液B（按照細(xì)胞裂解緩沖液A體積的1/20加入），混勻，冰浴5-10分鐘。
注1：此步驟盡量不要漩渦震蕩沉淀，否則得到的細(xì)胞漿蛋白可能會污染核蛋白。
注2：裂解緩沖液對不同細(xì)胞的裂解能力有不同，敏感細(xì)胞裂解5分鐘足夠，其他細(xì)胞冰浴時間不要超過10分鐘。
1.4.3
4℃ 16000g 離心5分鐘，取80%上清即為胞漿蛋白，保存?zhèn)溆谩?
注：吸取上清時千萬不要觸及沉淀，可以只取80%體積上清，以免胞漿蛋白中污染細(xì)胞核。每5-10×106細(xì)胞用400
μl細(xì)胞裂解緩沖液A裂解后獲得的上清，其細(xì)胞漿蛋白濃度約為1-2 μg/μl，不同細(xì)胞略有不同。
1.5
收集細(xì)胞核：
1.5.1
徹底去除步驟1.4.3離心管內(nèi)上清，沉淀中再次加入400
μl細(xì)胞裂解緩沖液A（含PMSF和DTT），用1 ml吸頭吹打重懸沉淀至沉淀完全散開（注：渦旋震蕩不易懸浮沉淀），冰浴5分鐘。
注：此步驟目的是徹底漂洗沉淀中殘余的未裂解細(xì)胞，可以大大提高細(xì)胞核的純度
1.5.2
4℃ 16000g 離心5-10分鐘，徹底去除上清，沉淀即為完整的細(xì)胞核。
注：盡量完全把上清去除干凈，否則細(xì)胞核中會污染胞漿蛋白。
1.5.3
細(xì)胞核沉淀中加入50
μl細(xì)胞核貯存緩沖液，用吸頭完全重懸沉淀，得到細(xì)胞核溶液。該溶液可以-80℃貯存。
1.5.4 可選步驟：取10 μl細(xì)胞核溶液，加入10 μl臺盼藍(lán)染色液，混勻后，常溫放置2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞核的染色情況，提取良好的細(xì)胞核為均一藍(lán)色，沒有粘連（如圖）。
1.6 細(xì)胞核蛋白提?。?/b>
1.6.1 變性核蛋白提?。?/b>
注：此步驟使用含有SDS的提取試劑B，完全裂解核膜，釋放出細(xì)胞核內(nèi)容物，提取的是完全變性的核蛋白，適用于SDS-PAGE電泳Western
Blot檢測。
1.6.1.1
取一管50
μl細(xì)胞核溶液，4℃
16000g 離心2分鐘，去除上清，保留沉淀。
1.6.1.2
沉淀中加入100
μl核蛋白提取試劑I（變性）（含PMSF和DTT）和1
μl Benzonase，吸頭重懸沉淀，37℃處理30分鐘至幾乎無可見不溶物。
注：加入核蛋白提取試劑I（變性）后，細(xì)胞核裂解釋放出大量核酸，溶液非常粘稠，核酸酶Benzonase可以消化掉核酸，降低粘度。
1.6.1.3
4℃16,000g離心10分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的變性核蛋白。可以立即使用，也可以-80℃凍存。每5-10×106細(xì)胞用100微升提取試劑B裂解后獲得的上清，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）測定濃度，其核蛋白濃度約為1-3
μg/μl，不同細(xì)胞略有不同。
1.6.2 非變性核蛋白提取：
注：此步驟使用高鹽緩沖液使得細(xì)胞核收縮，核酸結(jié)合蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子）與核酸分離，擴散到細(xì)胞核外部，離心后上清中為非變性（活性）核蛋白，適用EMSA，轉(zhuǎn)錄因子活性分析等實驗。
1.6.2.1
取一管50
μl細(xì)胞核溶液，4℃
16000g 離心2分鐘，去除上清，保留沉淀。
1.6.2.2
沉淀中加入50
μl核蛋白提取試劑II（非變性）（含PMSF，不要添加DTT），吸頭重懸沉淀，4℃旋轉(zhuǎn)混勻30
min，至最后得到的溶液無可見懸浮物。
注：如不能旋轉(zhuǎn)混勻，可以冰浴30 min，每隔5分鐘混勻一次。
1.6.2.3
4℃16,000g離心10分鐘，立即吸取上清至一預(yù)冷的離心管中，即為抽提得到的活性核蛋白?？梢粤⒓词褂茫部梢?80℃凍存。每5-10×106細(xì)胞用50微升核蛋白提取試劑II（非變性）裂解后獲得的上清，可以使用BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：RTP7102）測定濃度，其細(xì)胞核蛋白濃度約為1-3
μg/μl，不同細(xì)胞略有不同。
二 關(guān)于胞漿蛋白和核蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量的評價：
2.1蛋白產(chǎn)量：
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細(xì)胞系
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細(xì)胞數(shù)量
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胞漿蛋白
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核蛋白
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K562
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1×107
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~0.8 mg
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~0.2 mg
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HEK293
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4×107
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~9.4 mg
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~0.55 mg
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Jurkat
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1.5×107
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~2.6 mg
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~0.23 mg
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Hela
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5.4×106
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~1.9 mg
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~0.34 mg
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NIH-3T3
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7.9×106
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~1.9 mg
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~0.28 mg
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2.2 胞漿蛋白和核蛋白質(zhì)量評價：
蛋白分區(qū)提取的質(zhì)量評價首先看提取的蛋白是否是分區(qū)蛋白，其次要看分區(qū)蛋白是否有明顯的富集，其三要看提出的分區(qū)蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的分區(qū)蛋白中是否可以檢測出目的蛋白。使用專門的胞漿內(nèi)參和細(xì)胞核檢測（下表），可以初步確認(rèn)提出的是胞漿蛋白還是核蛋白。蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對照，與總蛋白相比，胞漿蛋白內(nèi)參或核內(nèi)參是否有明顯富集。交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測蛋白樣品，如關(guān)注胞漿蛋白中是否有細(xì)胞核蛋白污染，可以使用核蛋白內(nèi)參如Lamin
B1檢測胞漿蛋白，檢測無條帶即說明胞漿蛋白與細(xì)胞核組分無交叉污染。用目標(biāo)蛋白抗體檢測分區(qū)蛋白，驗證是否可以檢測到目的蛋白，蛋白大小是否符合預(yù)期。
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位置
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內(nèi)參名稱
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大小 kD
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胞漿蛋白內(nèi)參
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GAPDH
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37
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β-Actin
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45
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β-Tubulin
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55
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推薦
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核內(nèi)參
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Histone H3
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17
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存在于線粒體中，胞漿中可以檢測到
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PCNA
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36
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Lamin B1
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68
|
推薦
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三 實驗示例：
Jurkat總蛋白，細(xì)胞漿蛋白，細(xì)胞核蛋白GAPDH檢測
總蛋白提取：4×106 K562細(xì)胞，400 g 離心收集，去上清，沉淀中加入200
μl RIPA（加2 μl 100 mM PMSF），冰上裂解5分鐘，4℃
16000 g 15 分鐘，上清即為總蛋白（TP）。
細(xì)胞漿蛋白：4×106 K562細(xì)胞，400 g 離心收集，加入400
μl細(xì)胞裂解緩沖液A （加4
μl 100mM PMSF，加0.4 μl 1 M DTT），懸浮沉淀，冰浴5分鐘；加入20
μl細(xì)胞裂解緩沖液B，混勻，冰上孵育5分鐘，4℃
16000g 5分鐘，小心收集上清即為細(xì)胞漿蛋白（CP），不要觸及沉淀。
細(xì)胞核蛋白提?。?/b>沉淀中計入100
μl核蛋白提取試劑I（變性），1
μl Benzonase，37℃ 30 min，4
℃ 16000 g 10分鐘，上清即為細(xì)胞核蛋白（NP）。
電泳：RTD6117-0420 200V 33-12 mA 55 min
轉(zhuǎn)膜：NC膜，1×RealBlot快速轉(zhuǎn)膜液濕轉(zhuǎn)，穩(wěn)流400
mA，電壓變化64-57 V，轉(zhuǎn)膜時間35
min
封閉：無蛋白快速封閉液RT 10 min
一抗孵育；二抗孵育；檢測：ECL發(fā)光檢測