動(dòng)物線粒體提取試劑盒（細(xì)胞樣品）

          (Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)     

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

動(dòng)物細(xì)胞線粒體提取試劑盒(Animal Cell Mitochondria Isolation Kit)可以快速便捷分離培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體。試劑盒的緩沖系統(tǒng)不含任何表面活性劑和螯合劑EDTA，分離獲得的線粒體純度較高，并且絕大部分分離獲得的線粒體都含有完整的內(nèi)膜和外膜，可以用于線粒體的生理功能等方面的研究。另外，優(yōu)化的裂解配方配套離心柱法有效裂解細(xì)胞，省去了經(jīng)典方法使用玻璃勻漿器的繁瑣操作，更加省時(shí)省力。同時(shí)，本試劑盒在分離線粒體的同時(shí)可以獲得去除線粒體的細(xì)胞胞漿蛋白，可以研究線粒體蛋白向胞漿內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制。

該產(chǎn)品約30分鐘即可完成培養(yǎng)細(xì)胞線粒體的提取。線粒體是在溫和、非變性條件下提取的，結(jié)合不同的溶解液，溶解后的線粒體可以用于SDS-PAGE變性電泳檢測(cè)、Blue Native非變性電泳檢測(cè)以及等電聚焦電泳等。另外，提取的線粒體具有生理功能，可以用于線粒體的生理功能等方面的研究。

按照每次提取2×10⁷細(xì)胞計(jì)算，試劑盒可以使用大約50次。

● 產(chǎn)品組成

● 貯存條件和運(yùn)輸：

按照標(biāo)簽溫度貯存；有效期一年；濕冰運(yùn)輸。

● 用前必讀：

1. 離心機(jī)請(qǐng)調(diào)整成RCF/g模式，按照離心力設(shè)置離心機(jī)（不要根據(jù)轉(zhuǎn)速rpm模式設(shè)置），所有離心步驟都需要在4℃低溫離心機(jī)中進(jìn)行。

2. 將分離緩沖液A，分離緩沖液B，漂洗緩沖液和貯存緩沖液混勻后放置于冰上。將離心柱套入2 ml連蓋收集管中，蓋好管蓋，放置于冰上預(yù)冷。

3. 蛋白提取推薦添加蛋白酶抑制劑（自備，試劑盒不提供），根據(jù)蛋白酶抑制劑母液濃度提前添加在膜蛋白提取溶液中（如抑制劑母液是 100×，添加時(shí)按照1:100添加，即1ml膜蛋白提取溶液添加10μl抑制劑）。研究蛋白磷酸化，需要添加磷酸酶抑制劑（自備，試劑盒不提供）。

4. 蛋白定量推薦使用BCA方法，可以選擇BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：RTP7102）。

● 使用方法：

一. 準(zhǔn)備溶液：

常溫溶解試劑盒中的各種溶液，溶解后立即置于冰上并混勻。如果最終實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖侵苽渚€粒體蛋白樣品，根據(jù)樣品數(shù)量，取適量體積分離緩沖液A加入蛋白酶抑制劑。按照下表大體估算分離緩沖液A的使用體積：

注:(二百萬(wàn)，2×10⁶)HeLa細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）大約為20 μl。

二. 收集細(xì)胞：

2.1 對(duì)于貼壁細(xì)胞：細(xì)胞用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，或用0.02% EDTA（0.5 mM）溶液處理細(xì)胞使細(xì)胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細(xì)胞。400 g（~2000 rpm） 4℃離心5 min收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細(xì)胞，以免胰酶降解需提取的目的蛋白。

2.2 對(duì)于懸浮細(xì)胞：400 g（~2000 rpm）4℃離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗一遍，離心收集細(xì)胞，盡最大努力吸盡上清，留下細(xì)胞沉淀備用。

三. 裂解細(xì)胞膜：

3.1細(xì)胞沉淀中加入250 μl準(zhǔn)備好的分離緩沖液A（含蛋白酶抑制劑），用移液器吹打重懸細(xì)胞沉淀，渦旋劇烈震蕩30-60秒，冰浴處理10分鐘，間歇2-3混勻。

注：建議將起始細(xì)胞數(shù)不要低于2×10⁷，否則將導(dǎo)致最后線粒體得率過(guò)低。

3.2 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心柱中，蓋上管蓋，16,000 g（~13000 rpm） 4℃離心1分鐘，離心后收集管底部會(huì)有沉淀形成。

     注：離心柱最大體積為600 μl；確保離心機(jī)可以在10秒內(nèi)達(dá)到16000 g。

3.3 棄去離心柱，蓋好2 ml收集管管蓋，用1ml移液器輕柔吹打重懸收集管中的沉淀。

四. 去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞：

溶液700 g（~2700 rpm） 4℃離心1分鐘，用200 μl吸頭小心將上清（上清稍有渾濁）轉(zhuǎn)移到新的1.5 ml離心管中。注意：轉(zhuǎn)速不要超過(guò)700g，否則會(huì)降低線粒體的得率。

關(guān)鍵步驟：吸取上清時(shí)不要觸及沉淀，甚至可以丟棄部分上清不吸取，以免上清（含線粒體）中污染核蛋白。如果使用250 μl分離緩沖液A，建議吸取200 μl上清。此步驟得到的細(xì)胞核純度不高，混雜有沒(méi)有完全破碎的完整細(xì)胞，不建議用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

五. 收集線粒體：

5.1 上清中加入等體積的分離緩沖液B（如步驟4吸取200 μl上清，則加入200 μl分離緩沖液B），混勻；

5.2 16000 g（~13000 rpm） 4℃離心10分鐘，用200 μl吸頭吸去上清，沉淀即為提取的線粒體。上清是胞漿蛋白，如需要可保存?zhèn)溆谩?

關(guān)鍵步驟：此步驟必須完全將上清吸取干凈，可以用200μl吸頭分次吸取上清，最后用10 μl吸頭將殘余上清徹底吸凈，以免線粒體中污染胞漿蛋白。

六. 線粒體漂洗：

   線粒體沉淀中加入0.5 ml 漂洗緩沖液，輕柔重懸沉淀，16,000 g，4℃離心5分鐘，棄上清，沉淀即為漂洗后的線粒體。

七. 線粒體的使用：

7.1 線粒體功能研究：

如果用于完整線粒體的功能或酶活性研究，初始2×10⁷細(xì)胞分離得到的線粒體樣品中加入100-150 μl線粒體貯存緩沖液，重懸線粒體后-80℃?zhèn)溆?。不建議長(zhǎng)期貯存，盡快使用。

7.2 線粒體蛋白電泳：

7.2.1線粒體蛋白變性樣品處理：

7.2.1.1 初始2×10⁷細(xì)胞分離得到的線粒體沉淀中建議使用50 μl變性蛋白溶解液（貨號(hào)：PS1020）溶解線粒體沉淀；

7.2.1.2 BCA方法測(cè)定蛋白濃度（貨號(hào)：RTP7102）；

7.2.1.3用變性蛋白溶解液調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.1.4取一管50 μl樣品加入SDS-PAGE上樣緩沖液（貨號(hào)：PL080，PL113，PL121）處理，建議調(diào)整上樣液濃度為0.5 μg/μl；對(duì)于多次跨膜蛋白（Multi-pass membrane protein）的變性電泳檢測(cè)，樣品建議使用37℃處理30分鐘，不要95℃加熱5分鐘，因?yàn)樵?5℃高溫情況下，多次跨膜蛋白極易聚集形成多聚體，樣品會(huì)聚集，WB檢測(cè)會(huì)表現(xiàn)為比實(shí)際蛋白大小更大的分子量；

7.2.1.5 使用SDS-PAGE凝膠（貨號(hào)：RTD6132，RTD6116）電泳，每個(gè)泳道上樣10-40 μl（5-20 μg）。

7.2.2 線粒體蛋白BN非變性樣品處理：

7.2.2.1 初始2×10⁷細(xì)胞分離得到的線粒體沉淀中建議使用50 μl膜蛋白重懸液（BN電泳用）（貨號(hào):PN1020）重懸線粒體沉淀；

7.2.2.2 BCA方法測(cè)定蛋白濃度（貨號(hào)：RTP7102）；

7.2.2.3 用膜蛋白重懸液（BN電泳用）（貨號(hào)：PN1020）調(diào)整蛋白濃度為1 μg/μl，按需分裝，每管50 μl，-80℃保存待用；

7.2.2.4 取一管50 μl樣品，溶化混勻后4℃ 16000 g 5分鐘，去除上清，保留沉淀；

7.2.2.5 沉淀中加入50 μl膜蛋白增溶液A（貨號(hào)：DM1080），輕柔重懸沉淀，盡量不產(chǎn)生氣泡，冰浴10分鐘；

7.2.2.6 4℃ 16000 g 15分鐘，取上清至一干凈1.5 ml離心管中即為增溶后線粒體蛋白溶液（小心不要吸取沉淀），此時(shí)得到的線粒體蛋白濃度為1 μg/μl，其中去垢劑DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為1%；

7.2.2.7 線粒體蛋白溶液中加入1/10體積10×膜蛋白A型上樣緩沖液（配套膜蛋白增溶液A使用）（貨號(hào)：PL130），使用BN凝膠電泳（貨號(hào)：RTD6139，RTD6140），每個(gè)泳道上樣5-20 μg。

7.2.3 線粒體蛋白等電聚焦樣品處理（2D凝膠第一維電泳）：

建議線粒體沉淀中使用溶解液：7 M尿素,2 M硫脲, 2%CHAPS,20 mM DTT(自備，試劑盒不提供)。

八 線粒體產(chǎn)量和質(zhì)量的評(píng)價(jià)：

8.1 線粒體產(chǎn)量：

8.2 線粒體質(zhì)量評(píng)價(jià)：

線粒體質(zhì)量評(píng)價(jià)首先看提取的線粒體是否具有完整的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)（進(jìn)行線粒體功能活性研究），其次要看裂解后的線粒體蛋白是否有明顯的富集，其三要看裂解后的線粒體蛋白是否有其他組分交叉污染，最后看提取的線粒體中是否可以檢測(cè)出目的蛋白。使用專門的線粒體內(nèi)參檢測(cè)（下表），可以初步確認(rèn)提出的是線粒體蛋白。線粒體蛋白是否有效富集需要用總蛋白作為對(duì)照，與總蛋白相比，線粒體內(nèi)參蛋白是否有明顯富集。線粒體蛋白中的交叉污染可以用其他組分內(nèi)參檢測(cè)線粒體蛋白樣品，如關(guān)注線粒體蛋白中是否有胞漿蛋白污染，可以使用胞漿蛋白內(nèi)參檢測(cè)線粒體蛋白，檢測(cè)條帶的強(qiáng)弱即說(shuō)明線粒體蛋白與胞漿蛋白交叉污染的程度。用目標(biāo)蛋白抗體檢測(cè)線粒體蛋白，驗(yàn)證是否可以檢測(cè)到目的蛋白，蛋白大小是否符合預(yù)期。

許多研究人員利用 WB對(duì)分離的線粒體蛋白進(jìn)行純度檢測(cè)，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些常用的胞漿內(nèi)參能在線粒體蛋白中檢測(cè)到，例如β-actin^[1], GAPDH ^[2] 和 β-tubulin，這是由于這些胞漿內(nèi)參不僅存在于胞漿也存在于線粒體中，因此可以在線粒體蛋白中檢測(cè)到胞漿內(nèi)參。更多信息，請(qǐng)參閱以下論文：

1 Hatch, Anna L., Pinar S. Gurel, and Henry N. Higgs. Novel roles for actin in mitochondrial fission. Journal of Cell Science (2014) 127, 1–12

2 Zhang, Jin-Ying, et al. Critical protein GAPDH and its regulatory mechanisms in cancer cells. Cancer Biol Med 2015;12:10-22.

九 實(shí)驗(yàn)示例：

不同去垢劑處理K562細(xì)胞線粒體3-12%BN電泳