動物組蛋白提取試劑盒
(Animal
Total Histone Extraction Kit)
|
產(chǎn)品貨號
|
名稱
|
規(guī)格
|
|
RTD8110
|
動物組蛋白提取試劑盒
|
50次
|
● 產(chǎn)品簡介
組蛋白（Histone）是指所有真核生物的細胞核中，與DNA結(jié)合存在的堿性蛋白質(zhì)的總稱，它和DNA共同組成核小體結(jié)構(gòu)。它們是染色質(zhì)的主要蛋白質(zhì)組分，作為DNA纏繞的線軸，并在基因調(diào)控中發(fā)揮作用。組蛋白通常含有H1，H2A，H2B，H3，H4等5種成分。除H1外，其他4種組蛋白均分別以二聚體(共八聚體）相結(jié)合，形成核小體核心。DNA便纏繞在核小體的核心上。而H1則與核小體間的DNA結(jié)合。因此，一般認為組蛋白作為結(jié)構(gòu)支持體的作用比其基因調(diào)節(jié)作用更為重要。組蛋白可受到甲基化、乙?；?、磷酸化、聚ADP核糖?；约芭c泛醌(ubiquinone）相結(jié)合等幾種類型的修飾。組蛋白的修飾與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化及基因活性的控制關系緊密。
該試劑盒采用優(yōu)化配方，可以迅速從細胞或組織中提取組蛋白，同時配套有HDAC(Histone
deacetylase，組蛋白去乙?；?抑制劑，可以維持組蛋白?；?。
對于細胞樣品，如果每個樣品的數(shù)量不超過一千萬個（107）細胞（細胞沉淀體積PCV
100 μl），本試劑盒可以抽提50個樣品；對于組織樣品，如果每個樣品的重量不超過50
mg，本試劑盒可以抽提50個樣品。每一千萬細胞或100
mg組織提取的組蛋白含量約為0.4 mg。
● 產(chǎn)品組成
|
產(chǎn)品編號
|
名稱
|
規(guī)格
|
貯存
|
|
RTD8110-01
|
裂解緩沖液
|
100 ml
|
4℃
|
|
RTD8110-02
|
提取緩沖液
|
15 ml
|
4℃
|
|
RTD8110-03
|
中和緩沖液
|
5 ml
|
4℃
|
|
RTD8110-04
|
去乙?；敢种苿?/span>40×）
|
5 ml
|
-20℃
|
|
RTD8110-05
|
1 M DTT（500×）
|
0.1 ml
|
-20℃
|
|
RTD8110-06
|
PMSF（100×）
|
1.5 ml
|
-20℃
|
● 貯存條件和運輸：
按照標簽溫度貯存，一年有效；試劑盒濕冰運輸。
● 使用方法：
一 培養(yǎng)細胞組蛋白提?。?/b>
1.1 即用型裂解緩沖液配制：
常溫融解試劑盒中的試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當體積的裂解緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的PMSF（100×）和1/50體積去乙?；敢种苿?0×），配成
即用型裂解緩沖液，隨后立即放于冰上待用。
1.2 準備細胞：
1.2.1
對于貼壁細胞：用PBS漂洗一遍，棄PBS；再加入適量PBS，用細胞刮刀刮下細胞，或用0.02%
EDTA（0.5
mM）溶液處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。450
g 4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解需要抽提的目的蛋白。
1.2.2
對于懸浮細胞：450
g 4℃離心5
min收集細胞，用PBS洗一遍，離心收集細胞，盡最大努力吸盡上清，留下細胞沉淀備用。
1.3 按照下表加入各種試劑體積：
|
細胞數(shù)量
|
細胞沉淀體積（PCV）（μl）
|
即用型裂解緩沖液（μl）
第一次裂解
|
即用型裂解緩沖液（μl）
第二次裂解
|
|
1×107
|
100
|
1000
|
500
|
注：1×107(一千萬)HeLa細胞，其細胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）約為100 μl。
1.4 細胞裂解：
1.4.1第一次裂解：細胞沉淀中加入即用型裂解緩沖液（10倍PCV體積），用移液器吹打重懸細胞沉淀，不要渦旋震蕩，把細胞沉淀完全懸浮并分散開,冰浴15分鐘，間歇混勻。
1.4.2
第二次裂解：600
g 4℃離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上清，細胞沉淀中加入即用型裂解緩沖液（5倍PCV體積）。
1.4.3
勻漿：用超聲破碎細胞（推薦130W功率超聲1分鐘，超聲2秒，停頓3秒）或用玻璃勻漿器冰浴勻漿5-10次或使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號：PE2719，蛋白提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物，冰浴處理15分鐘。
注：此步驟不要過度勻漿或超聲處理，否則得到的組蛋白會污染較多的胞漿蛋白，可以用臺盼藍染色觀察細胞裂解情況，建議70-80%細胞裂解為適宜裂解程度。加入裂解緩沖液后，細胞膜完全破裂，胞漿完全釋放，但細胞核保持完整。鏡檢下可以看到完全染成藍色的細胞核。
1.4.4 4℃16,000g離心15分鐘，去掉上清，保留沉淀。
1.5 細胞組蛋白提?。?/b>
1.5.1 沉淀重懸于0.25 ml 提取緩沖液中，超聲處理（推薦130W功率超聲2分鐘，超聲2秒，停頓3秒），冰浴30分鐘，間歇混勻。
注：超聲處理為必須步驟，否則沉淀很難徹底溶解，大大降低組蛋白提取得率。
1.5.2 4℃ 16000g 離心10分鐘，收集組蛋白上清。
1.5.3 即用型中和緩沖液配制：
取適當體積的中和緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的PMSF（100×），1/40體積去乙酰化酶抑制劑和1/500體積
1M DTT，配成即用型中和緩沖液，隨后立即放于冰上待用。
1.5.4 組蛋白上清中加入0.3倍體積即用型中和緩沖液，混勻，即為組蛋白提取溶液。
注：組蛋白溶液電泳檢測時，如果加入上樣緩沖液后溶液變黃，加入1/10體積中和緩沖液將顏色調(diào)整為藍色后再上樣。
1.6 組蛋白貯存：
組蛋白溶液-20℃貯存一周或-80℃長期貯存。
二 新鮮組織組蛋白提?。?/b>
2.1即用型裂解緩沖液配制：
常溫融解試劑盒中的試劑，溶解后立即放置在冰上，混勻。取適當體積的裂解緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的PMSF（100×）和1/40體積去乙酰化酶抑制劑，配成即用型裂解緩沖液，隨后立即放于冰上待用。
2.2準備組織：
組織塊迅速置于預冷的1×PBS 中，漂洗數(shù)次，濾紙吸干水分，將組織切成細小的組織塊，稱重組織，按照下表加入各試劑的量
|
組織重量（mg）
|
即用型裂解緩沖液（μl）
第一次裂解
|
即用型裂解緩沖液（μl）
第二次裂解
|
|
50
|
1000
|
500
|
注：50
mg新鮮組織相當于細胞沉淀體積（PCV，Packed Cell Volume）約為100 μl。
2.3 組織裂解：
2.3.1第一次裂解：組織中加入即用型裂解緩沖液（10倍PCV體積），用玻璃勻漿器冰浴勻漿10-20次,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
2.3.2 第二次裂解：4℃ 600 g離心5
min收集細胞，盡最大努力吸盡上清，細胞沉淀中加入即用型裂解緩沖液（5倍PCV體積）。
2.3.3用超聲破碎細胞（推薦130W功率超聲1分鐘，超聲2秒，停頓3秒）或用玻璃勻漿
器冰浴勻漿5-10次或使用注射器用27G針頭處理裂解物10-15次（貨號：PE2719，蛋白提取針頭套裝）,以徹底裂解細胞，收集裂解混合物，冰浴處理15分鐘。
注：此步驟不要過度勻漿或超聲處理，否則得到的組蛋白會污染較多的胞漿蛋白，可以用臺盼藍染色觀察細胞裂解情況，建議70-80%細胞裂解為適宜裂解程度。加入裂解緩沖液后，細胞膜完全破裂，胞漿完全釋放，但細胞核保持完整。鏡檢下可以看到完全染成藍色的細胞核。
2.3.4 16,000g 4℃離心15分鐘，去掉上清，保留沉淀。
2.4 組織組蛋白提?。?/b>
2.4.1 沉淀重懸于0.25 ml 提取緩沖液中，超聲處理（推薦130W功率超聲2分鐘，超聲2秒，停頓3秒），冰浴30分鐘，間歇混勻。
注：超聲處理為必須步驟，否則沉淀很難徹底溶解，大大降低組蛋白提取得率。
2.4.2 4℃16000g 離心10分鐘，收集組蛋白上清。
2.4.3 即用型中和緩沖液配制：
取適當體積的中和緩沖液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入1/100體積的PMSF（100×），1/40體積去乙?；敢种苿┖?/500體積
1M DTT，配成即用型中和緩沖液，隨后立即放于冰上待用。
2.4.4 組蛋白上清中加入0.3倍體積即用型中和緩沖液，混勻，即為組蛋白提取溶液。
注：組蛋白溶液電泳檢測時，如果加入上樣緩沖液后溶液變黃，加入1/10體積中和緩沖液將顏色調(diào)整為藍色后再上樣。
2.5 組蛋白貯存：
組蛋白溶液-20℃貯存一周或-80℃長期貯存。
三 實驗示例：
程序：收集2
ml 293細胞（細胞密度1×107），PBS漂洗2次，加入1
ml即用型裂解緩沖液，混勻，冰浴15分鐘；離心收集細胞，加入0.5
ml即用型裂解緩沖液，130W功率超聲1
min，冰浴15分鐘；16000
g離心15分鐘；沉淀中加入0.25
ml即用型提取緩沖液，130W功率超聲2分鐘，冰浴15分鐘；16000
g 離心15分鐘；收集0.2
ml組蛋白上清，加入60
μl中和緩沖液，即為組蛋白提取溶液。取40
μl組蛋白溶液，加20
μl 5×上樣緩沖液，20
μl水，10
μl中和緩沖液（溶液由黃色變?yōu)樗{色），制備為組蛋白上樣溶液，上樣5，10，15，20
μl。電泳后FastBlue染色30分鐘。