Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）
Blue/Clear Native PAGE Electrophoresis Kit Ver.731072
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貨號
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名稱
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包裝
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RTD6140
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Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒(手灌膠)
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10 次
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● 貨品內(nèi)容：
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組份
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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保存
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1
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RTD6140-01
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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40 ml
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4℃
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2
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AC2914-30ml
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40%
PAA（29:1）
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30 ml
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4℃
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2
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BC500P
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液(干粉)
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500 ml
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RT
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3
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PL114-01
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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1 ml
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-20℃
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4
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BC270
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2% G-250染料（電泳用）
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20 ml
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RT
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5
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BC260-01
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5% G-250染料（上樣用）
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1 ml
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4℃
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6
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SR0510
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濃縮膠紅色添加染料(200×)
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0.5 ml
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RT
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7
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AP020P
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APS（干粉）
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0.5 g
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RT(配制后-20℃貯存)
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8
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TA0761
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TEMED
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0.5 ml
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4℃ 避光
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9
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說明書
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一份
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● 產(chǎn)品簡介：
Blue/Clear Native PAGE（BN/CN-PAGE）是一種從生物樣品（質(zhì)膜，胞漿等）中分離分子量10 kD-10 M kD 范圍的蛋白質(zhì)復(fù)合物的電泳技術(shù)。其原理是用溫和去污劑(如 DDM，digitonin)將蛋白復(fù)合體從細胞膜中以近似天然的狀態(tài)分離出來，Blue Native PAGE （BN-PAGE）是用考馬斯亮藍 G-250 代替 SDS與蛋白結(jié)合而使其帶負電荷，根據(jù)蛋白分子量不同在 PAGE膠中得到分離；Clear Native PAGE（CN-PAGE）是電泳緩沖液中不加入任何染料，電泳中始終保持蛋白的天然電荷和活性狀態(tài)，然而，其蛋白的分辨率要低于Blue Native PAGE。另外，BN-PAGE由于考馬斯亮藍G-250存在，使蛋白都覆蓋上負電荷，可以分離堿性蛋白（pI＞7）和酸性蛋白(pI＜7)；而CN-PAGE只適合于酸性蛋白（pI＜7）的分離。
本產(chǎn)品包括BN/CN-PAGE制膠的所有成分，方便使用?？梢杂糜诜蛛x分子量在 10 kD-500 kD 的蛋白復(fù)合體，樣品可以來于胞漿、細胞總裂解液、細胞膜、線粒體膜和葉綠體膜等。電泳后可直接用于考染、銀染、Western 雜交、SDS-PAGE電泳、蛋白純化、蛋白活性檢測等分析實驗，也可直接用于電洗脫制備蛋白。
試劑盒配套有紅色濃縮膠添加染料,凝固后的濃縮膠為紅色,有利于在藍色電泳緩沖液中觀察加樣孔,方便上樣。
本試劑盒大約可以配制8-25塊常規(guī)大?。?×10 cm）PAGE凝膠，具體數(shù)量根據(jù)凝膠濃度和厚度決定，1 mm厚度8%凝膠可以配制至少10塊膠。
● 運輸和貯存：
本產(chǎn)品常溫運輸；組份按照標簽溫度貯存；有效期一年。
● 使用說明：
一. 樣品制備：
該試劑盒不含樣品制備的相關(guān)試劑，根據(jù)樣品種類，具體選擇不同提取方法。植物類囊體BN樣品制備可以選擇植物類囊體膜提取試劑盒（貨號：RTU5002）；動物總蛋白BN樣品制備可以選擇動物胞漿活性蛋白提取試劑盒（不含去垢劑，離心柱法）（貨號：RTD8106）；動物膜蛋白BN樣品制備可以選擇動物膜蛋白提取試劑盒(細胞)（貨號：RTD8111）和動物膜蛋白提取試劑盒(組織)（貨號：RTD8112）；動物線粒體BN樣品制備可以選擇動物細胞線粒體提取試劑盒（貨號：RTD8115）和動物組織線粒體提取試劑盒（貨號：RTD8117）。
二. 制膠：
2.1 分離膠制備：
2.1.1 不同濃度的分離膠的最佳分離范圍：
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分離膠濃度
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最佳分離范圍
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6%
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80-500 kD
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8%
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50-350 kD
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10%
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20-150 kD
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12%
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15-100 kD
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15%
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10-80 kD
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2.1.2根據(jù)表一，將不同體積的成分在小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡
2.1.3在凝膠模具中灌入適量分離膠溶液（對于mini-gel，凝膠液加至約距前玻璃板頂端1.5 cm或距梳齒約0.5 cm即可），然后在分離膠溶液上輕輕覆蓋一層1-3 cm的水層，使凝膠表面保持平整。
2.1.4靜置15-30分鐘，待分離膠和水層之間出現(xiàn)一個清晰的界面后，說明凝膠已聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
表一 Blue/Clear Native PAGE分離膠配方表
（以一塊1.0 mm厚度mini膠為例）
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分離膠總體積 5 ml
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6%
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8%
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10%
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12%
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15%
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組份
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組份加入體積（ml）
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滅菌水
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1.7
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1.45
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1.2
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0.95
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0.57
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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2.5
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40％ PAA（29:1）
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0.75
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1
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1.25
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1.5
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1.875
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10％ APS
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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0.05
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TEMED
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0.005
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0.005
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0.005
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0.005
|
0.005
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2.2 濃縮膠制備：
2.2.1去除覆蓋在分離膠上的水層。
2.2.2按照表二將不同成分在一個小燒杯中混合，輕輕攪拌使其混勻，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.3將濃縮膠溶液加至分離膠的上面，直至凝膠溶液到達前玻璃板的頂端。
2.2.4將梳子插入凝膠內(nèi)，避免產(chǎn)生氣泡。
2.2.5靜置30-60分鐘，等待濃縮膠聚合。
注：凝膠的聚合時間與環(huán)境溫度有關(guān)。夏天溫度較高時，聚合較快；冬天氣溫低時，聚合時間會延長?？梢愿鶕?jù)環(huán)境溫度的不同調(diào)節(jié)APS的加入量。
表二 Blue/Clear Native PAGE濃縮膠（4%）配方表（以一塊1.0mm厚度mini膠為例）
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組份
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不同凝膠體積對應(yīng)各組份的取樣量
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濃縮膠總體積2 ml
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H2O
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0.8 ml
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2×BN/CN凝膠緩沖液
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1 ml
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40％ PAA（29:1）
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0.2 ml
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濃縮膠紅色添加染料(200×)
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10 μl
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10％ APS
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20 μl
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TEMED
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2 μl
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三. 電泳：
3.1 準備電泳緩沖液：
將10×BN/CN PAGE電泳緩沖液（干粉）溶于500 ml滅菌水中，徹底溶解，測定pH應(yīng)為7.0左右，不要調(diào)節(jié)pH。用前稀釋10倍即配成1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
3.1.1 CN-PAGE電泳：
陽極緩沖液和陰極緩沖液均直接使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液進行電泳。
3.1.2 BN-PAGE電泳：
陽極緩沖液(外槽)使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，陰極緩沖液(內(nèi)槽)按照下表配制：
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1×藍色陰極緩沖液
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150 ml
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10×BN/CN PAGE電泳緩沖液
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15
ml
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2% G-250 染料（電泳用）
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1.5 ml
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超純水
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定容至150
ml
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3.2 準備樣品：
3.2.1 CN-PAGE電泳：
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總體積
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10
μl
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蛋白樣品
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x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
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超純水
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補至10 μl
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|
|
不要加熱
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3.2.2 BN-PAGE電泳：
3.2.2.1
植物類囊體膜蛋白電泳：
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總體積
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10
μl
|
|
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含去垢劑樣品*
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植物類囊體膜蛋白樣品
（2%DDM增溶）
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x μl
|
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
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5%
G-250染料（蛋白上樣）
|
1 μl
|
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超純水
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補至10 μl
|
|
|
不要加熱
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*植物類囊體膜蛋白電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
植物類囊體樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/4。例如樣品中DDM（n-Dodecyl β-D-maltoside，β-DM， n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷）終濃度為2%，則需要G-250終濃度為0.5%。10 μl蛋白樣品中需要加5%
G-250染料1 μl。
3.2.2.2
動物線粒體BN樣品電泳：
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總體積
|
10
μl
|
|
|
含去垢劑樣品*
|
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動物線粒體BN樣品
（1%DDM增溶）
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
|
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5%
G-250染料（蛋白上樣）
|
0.25 μl
|
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超純水
|
補至10 μl
|
|
|
不要加熱
|
*動物線粒體BN樣品電泳中，含去垢劑樣品中染料加入按照以下原則：
動物線粒體BN樣品中G250終濃度為去垢劑終濃度的1/8。例如樣品中DDM終濃度為1%，則需要G-250終濃度為0.125%。10 μl蛋白樣品中需要加5% G-250染料0.25 μl。
3.2.2.3
不含去垢劑樣品：
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總體積
|
10
μl
|
|
不含去垢劑樣品
|
x μl
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4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液
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2.5 μl
|
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5%
G-250染料（蛋白上樣）
|
- #
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超純水
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補至10 μl
|
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不要加熱
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# 不含去垢劑樣品可以不必添加5%G-250染料。
3.3電泳過程；
3.3.1 CN-PAGE電泳：
電泳內(nèi)外槽均使用1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。在電泳槽的內(nèi)槽內(nèi)加入1×BN/CN PAGE電泳緩沖液(讓電泳緩沖液漫過加樣孔)，輕輕撥出預(yù)制膠梳子，用1ml吸頭沖洗加樣孔3次，隨后在電泳槽外槽加入適量的1×BN/CN PAGE電泳緩沖液。
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CN-PAGE電泳
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恒電壓
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起始電流
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結(jié)束電流
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電泳時間
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120V
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10-15mA/板膠
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4-10mA/板膠
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50+min
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注：冰浴電泳
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3.3.2 BN-PAGE電泳：
BN-PAGE電泳外槽使用1×BN/CN電泳緩沖液；內(nèi)槽開始電泳使用的是1×藍色陰極緩沖液，冰浴電泳，等待電泳指示前沿到達距離凝膠頂部2/3處時，將電泳緩沖液更換為1×BN/CN電泳緩沖液，繼續(xù)后續(xù)電泳，因為過多染料會影響蛋白在凝膠中的遷移以及蛋白后續(xù)的轉(zhuǎn)膜實驗。
BN-PAGE電泳條件（一板膠）
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恒電壓
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起始電流
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電泳時間
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緩沖液
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120 V
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8-15 mA
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20-25
min
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1×藍色陰極緩沖液
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冰浴電泳
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指示前沿至凝膠頂部三分之二處，更換內(nèi)槽緩沖液為無色1×BN/CN
電泳緩沖液
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恒電壓
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繼續(xù)電泳時間
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結(jié)束電流
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緩沖液
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120 V
|
45 min
+
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3-5 mA
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1×BN/CN電泳緩沖液
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冰浴電泳
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四. 轉(zhuǎn)膜：
BN-PAGE轉(zhuǎn)膜必須用PVDF膜，不能用NC膜，因為NC膜與G-250結(jié)合非常緊密。
轉(zhuǎn)膜緩沖液可以使用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：BC600P）。
五. 染色：
5.1 將電泳后的PAGE膠取下放入塑料容器中，加入適量FastBlue蛋白染色液（以剛剛覆蓋過膠面為適），條帶1-2分鐘即可見。
5.2 搖床常溫搖動10-15分鐘至條帶清晰可見。
5.3 加入適量蒸餾水脫色，期間更換1-2次蒸餾水，搖床常溫搖動10-15分鐘至背景干凈。
5.4 觀察保存結(jié)果。
六. 實驗示例：
RTD6140 Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠） WB檢測
樣品處理：K562懸浮細胞提取胞漿活性蛋白（貨號：RTD6106 動物活性蛋白提取試劑盒（不含去垢劑））
4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號：PL114） 調(diào)整蛋白濃度為1μg/μl上樣液，梯度上樣5-20μg
電泳：8% BN手灌膠，穩(wěn)壓200V 1×藍色陰極緩沖液至指示前沿距離膠上沿2/3處，
更換為無色1×BN/CN PAGE電泳緩沖液，電泳時間共83分鐘
轉(zhuǎn)膜：0.45 μm PVDF膜，10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號：BC600P）稀釋為1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液加20%甲醇，
恒流200mA 2小時，未冰浴。
轉(zhuǎn)膜效果檢測：膜用麗春紅染色液染色（貨號：RTD6301）有可見條帶，膠用FastBlue蛋白染色液染色
（貨號：RTD6202）幾乎無條帶，證明轉(zhuǎn)膜成功。膜用無水甲醇清洗5分鐘去除膜上藍色殘余。
封閉：Western快速封閉液（貨號：WR5020） RT 封閉10 分鐘；
一抗：兔單抗GAPDH 1:10000 RT 60min；二抗：羊抗兔IgG-HRP 1:5000 RT 60min，
ECL檢測：RealECL發(fā)光液（貨號：EC2520），曝光1秒。
使用RTD6140
Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）產(chǎn)品發(fā)表部分文章列表：
1.
[2022 IF=2.9] Identification and structural analysis of
dimeric chicken complement
component 3d and its binding with
chicken complement receptor 2.
Author: Huan Jin, Min Tu, Zhaoying Meng, Bo Jiang,
Qianqian Yang, Yongqing Li,Zhenhua Zhang
Journal: Developmental and Comparative Immunology 152
(2024) 105109
Institution: Institute
of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Beijing Academy of Agriculture and
Forestry Sciences
Paper link：https://doi.org/10.1016/j.dci.2023.105109